【概要描述】兔视网膜色素上皮细胞的相关产品：A549+GFP+LUC人非小细胞大鼠原代小肠粘膜上皮细胞小鼠原代肠神经胶质细胞狗原代皮下微血管内皮细胞小鼠原代造血干细胞人原代胆囊成纤维细胞小鼠原代胰腺成纤维细胞兔原代肌腱细胞羊原代肺微血管内皮细胞兔原代滑膜间充质干细胞

兔视网膜色素上皮细胞

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传2-3代

消化液 0.25%yi蛋白酶

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

兔视网膜色素上皮分离自视网膜组织；视网膜居于眼球壁的内层，是一层透明的薄膜。视网膜由色素上皮层和视网膜感觉层组成，两层间在病理情况下可分开，称为视网膜脱离。色素上皮层与脉络膜紧密相连，由色素上皮细胞组成，它们具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。组织学上视网膜分为10层，由外向内分别为：色素上皮层、视锥、视杆细胞层、外界膜、外颗粒层、外丛状层、内颗粒层、内丛状层、神经节细胞层、神经纤维层、内界膜。视网膜内层为衬于血管膜内面的一层薄膜，有感光作用；后部鼻侧有一视神经乳头。视网膜上的感觉层是由三个神经元组成。神经元是视细胞层，专司感光，它包括锥细胞和杆细胞。视杆细胞主要在离中心凹较远的视网膜上，而视锥细胞则在中心凹处最多。第二层叫双节细胞，约有10到数百个视细胞通过双节细胞与一个神经节细胞相联系，负责联络作用。第三层叫节细胞层，专管传导。视网膜是一层菲薄的但又非常复杂的结构，它贴于眼球的后壁部，传递来自视网膜感受器冲动的神经纤维跨越视网膜表面，经由视神经到达出口。视网膜的分辨力是不均匀的，在黄斑区，其分辨能力强。视网膜色素上皮（RPE）位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道；主要是由单层色素上皮细胞所构成，排列十分规则。视网膜色素上皮参与shi黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。细胞呈多角形，细胞分为三部分，即顶部、体部和基底部。视网膜色素上皮细胞无再生能力，细胞死亡后不被替换，而是邻近的细胞向侧面滑动，以填补死亡细胞遗留下来的空间。视网膜色素上皮位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道。视网膜色素上皮参与shi黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。
方法简介：

公司实验室分离的兔视网膜色素上皮采用yi蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。
质量检测：

公司实验室分离的兔视网膜色素上皮经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

一、细胞培养

1取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的培养称为原代培养。2培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。3冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

二、原代细胞分离

凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。1悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。2实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。

三、细胞增殖检测技术

目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂

的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。

取材：首先，用培养液湿润所取的组织材料，并用锋利的眼科剪去除附在其上的脂肪和结缔组织。接着用平衡液（如PBS或Hanks液）漂洗，再用眼科弯剪将组织块剪成小块。多次用PBS或Hanks液漂洗，直到液体清亮、无油滴为止。

接种：用湿润的吸管吸取切碎的组织块，轻轻吹到培养瓶皿中，并按一定间距均匀放在培养瓶底壁上。注意不要过多，确保组织块切面贴在培养瓶底壁上。

培养：将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，避免组织块与培养液接触，然后塞紧瓶塞。将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中。待组织块贴壁1到3小时后翻瓶，使贴壁的组织块浸没在培养液中，继续静置。换液：每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。

一、原代细胞计数

将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

静置3分钟。

镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

二、原代细胞活力

将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。