莽草酸脱氢酶(SD)测试盒操作步骤
1. 样本预处理
取0.2g新鲜植物组织置于预冷的研钵中，加入1.5mL 0.1M磷酸缓冲液（pH7.5）冰浴研磨，4℃条件下12000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶提取液。注意：所有操作需在冰上完成，避免酶活性损失。
2. 反应体系构建
在1.5mL离心管中依次加入：
- 650μL 0.1M Tris-HCl缓冲液（pH8.0）
- 100μL 10mM NAD+
- 50μL 粗酶提取液
轻轻混匀后37℃水浴预热5分钟，设置空白对照组（用缓冲液替代酶液）。
3. 反应启动与监测
加入200μL 20mM莽草酸溶液启动反应，立即转移至分光光度计比色皿。在340nm波长下，每30秒记录一次吸光度值，持续监测10分钟。建议使用带恒温装置的分光光度计保持37℃测定环境。
4. 关键注意事项
（1）反应线性期判定：选择OD值变化呈直线的时间段（通常为前4分钟）计算酶活，R²应＞0.98；
（2）干扰排除：若样本含色素，需增设不加NAD+的对照管扣除本底；
（3）酶活计算：ΔA/min×反应体系总体积（μL）×稀释倍数/（6.22×光程cm×取样量μL），结果以U/g FW表示。
【常见问题解决方案】
- 反应速率过低：检查NAD+试剂是否失效，或尝试提高酶液浓度；
- 曲线非线性：可能样本中代谢物干扰，建议超滤纯化酶液；
- 数据波动大：确认比色皿清洁度，避免气泡干扰。
